小鼠脾臟樹突細胞的分離－膠原酶消化制備脾臟細胞懸液
2010-07-16
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輔助方案：
膠原酶消化制備脾臟細胞懸液
實驗材料：
1. 4000U/ml膠原酶D，融化后置于冰上
2. HBSS，已滅菌，含Ca+、Mg2+（購置于Life Technologies）
3. 小鼠脾臟
4. 皮下注射針，22G×11/2in內(nèi)徑（Becton Dickinson）
5. 10ml、5ml一次性注射器（如Becton Dickinson）
6. 100mm直徑培養(yǎng)皿（如Falcon）
7. 2個高壓滅菌鍋的鋸齒狀解剖鑷（如Roboz）
8. 高壓滅菌的不銹鋼網(wǎng)：將40目的不銹鋼網(wǎng)剪成5cm×5cm的小方格，向下折疊邊緣，然后將四邊彎成淺的矩形碗；錫箔紙包裹后高壓滅菌。
實驗方法：
1. 將2管1ml的4000U/ml膠原酶D稀釋（足夠用于20個脾臟）：1ml加入9ml HBSS（稀釋至4000U/ml，步驟8使用），1ml加入39ml的HBSS（稀釋至100 U/ml）。置于冰上。
2. 將22G針頭連接在10ml的注射器上，充滿100 U/ml的膠原酶。將10ml的100 U/ml溶液加入100mm的培養(yǎng)皿中。
3. 取另外一個直徑100mm的培養(yǎng)皿進行操作。一只手拿鑷子，另一只手拿注射器，拇指放在活塞上。用鑷子夾住小鼠脾臟，用針頭刺入脾臟被膜的狹窄邊緣，注入100 U/ml膠原酶100ml。用鑷子將脾臟推向針頭，使針頭前進幾毫米。重復注射膠原酶，繼續(xù)直到1ml膠原酶都注射入脾臟，針頭從另一端刺穿脾臟。
4. 用針頭撕開脾臟，將其轉(zhuǎn)移至含膠原酶的培養(yǎng)皿中（步驟2）。重復操作，直到所有脾臟都注射和撕開。
5. 從第二個培養(yǎng)皿中收集細胞懸液加入到置于冰上的50ml離心管中。用3ml 100 U/ml的膠原酶漂洗培養(yǎng)皿后加到上述50ml離心管中。
6. 加入3ml 100 U/ml膠原酶至培養(yǎng)皿中。將撕碎的脾臟依次轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿。用2個鑷子將它們撕成邊長1mm的小碎塊，使其能通過5ml吸管的內(nèi)徑。當所有的脾臟都撕碎后，將先前放置脾臟碎塊的培養(yǎng)皿中的膠原酶溶液加入進來，用5ml吸管猛烈吹打多次。
7. 傾斜培養(yǎng)皿，將大塊碎片除開，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至第5步的置于冰上的50ml離心管中。用幾毫升100 U/ml的膠原酶洗滌培養(yǎng)皿后加入至離心管中。
8. 在培養(yǎng)皿留下的脾臟碎塊中加入10ml 400 U/ml的膠原酶。吹打數(shù)次后于培養(yǎng)箱里放置30-90min。
9. 在孵育的zui后階段，猛烈吹打碎片，將其吸至直徑100mm培養(yǎng)皿的無菌鋼網(wǎng)上。
10. 用鑷子固定鋼網(wǎng)一端，用幾毫升100 U/ml膠原酶洗滌碎塊，然后用無菌的5ml注射器活塞碾磨碎塊。搗爛直到所有的紅色物質(zhì)從組織中去除。再用幾毫升100 U/ml膠原酶洗滌鋼網(wǎng)。
11. 將鋼網(wǎng)從培養(yǎng)皿中拿開，丟棄無色的黏附的被膜碎塊。猛烈地吹打培養(yǎng)皿中的液體，將其轉(zhuǎn)移至步驟7的50ml離心管里。用幾毫升100 U/ml膠原酶洗滌培養(yǎng)皿后一同加入到離心管中（約有0.5%為樹突細胞或者更少）。
12. 如果需要，即可用高密度的BSA離心。
附錄：
抗體偶聯(lián)的綿羊紅細胞（EA）：
以PBS洗滌2.5ml收集的綿羊紅細胞（Alsever液中提取；Cocalico）3次，每次洗滌后均以350g離心5min。然后用新鮮PBS稀釋為5%細胞懸浮液（109個細胞/ml）。將高致敏的兔抗紅細胞血清于5%細胞懸液以1：50稀釋（可能形成亞凝集劑量的抗體）。室溫下孵育2h，偶爾溫和地顛倒溶液。用RPMI1640（Life Technologies）洗滌形成的EA3次，隨后以PBS將EA稀釋為5%細胞懸液。于4℃保存2周，使用前再以RPMI洗滌一次。
RPMI-5*培養(yǎng)基：
RPMI1640培養(yǎng)基（Life Technologies），含有：
5%FBS，56℃熱滅活1h
10mmol/L HEPES
20mg/ml硫酸慶大霉素（Life Technologies）
50mmol/ml 2-ME
過濾除菌
高密度BSA溶液：
在1L容量瓶中，加入186ml PBS，29ml 1mol/L NaOH，65ml水（小心操作，注意液體不要再瓶內(nèi)飛濺）。不要攪拌，將106g BSA（Cohn fraction V，推薦采用*BSA）鋪在溶液表面，蓋上錫紙，冷藏過夜，使BSA慢慢溶解。
第二天，溫和搖晃已變?yōu)槌吻濉⑽⒑稚娜芤海粶y量折射指數(shù)，到小數(shù)點后第四位。25℃條件下，正確密度的BSA（1.080g/ml）的折射指數(shù)在1.384-1.385。為校正折射指數(shù)后，用試紙檢測pH。pH應在7.0-7.4，一般無需調(diào)整。
無菌過濾溶液。將47mm濾膜（Millpore type）置于一個500ml的過濾裝置（Nalgene#156-4045）頂部，先以少量BSA潤濕濾膜。真空抽濾數(shù)分鐘，直到BSA濾出為止。取下真空泵，小心將剩余的BSA溶液加入濾器上部的儲存器中（避免起泡沫。使用真空泵和濾器過濾剩余的BSA，≥10min）。4℃可保存3個月。
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