實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫(試劑不能直接在37℃溶解)；試劑或樣品稀釋時，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量，如樣品濃度過高時，應對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合ELISA試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應的稀釋倍數(shù)。
1.        加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標準品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應120分鐘。為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2.        棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100μl(在使用前一小時內配制)，酶標板加上覆膜, 37℃反應60分鐘。
3.        溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400μl/每孔，甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。
4.        每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液) 100μl，酶標板加上覆膜37℃反應60分鐘。
5.        溫育60分鐘后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。
6.        依序每孔加底物溶液90μl，酶標板加上覆膜37℃避光顯色(30分鐘內，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止)。
7.        依序每孔加終止溶液50μl，終止反應，此時藍色立轉。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。
8.        用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。 在加終止液后立即進行檢測。
ELISA試劑盒的實驗操作程序總結
1.準備試劑，樣品和標準品
2.加入準備好的樣品和標準品，37℃反應30分鐘
3.洗板5次，加入酶標試劑，37℃反應30分鐘
4.洗板5次，加入顯色液A、B，37℃反應10分鐘
5.加入終止液
6.15分鐘之內度OD值
7.計算
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