ELISA質量控制
ELISA 是一種敏感性高、特異性強、重復性好的實驗診斷方法，由于其試劑穩定、易保存、操作簡便、結果判斷較客觀等因素，以及既適宜于大規模篩查試驗又可以用于少量標本的檢測，既可以做定性試驗也可以做定量分析等優點，已廣泛應用于微生物學、寄生蟲學、腫瘤學和細胞因子等領域。ELISA 的影響因素較多，加強質量管理才能充分發揮其方法學的優點。

一、質量控制血清

質控血清是已有靶值的血清，在每次的常規檢驗中加入一份或數份，通過所得結果來了解本次檢驗的情況。質控血清檢驗的結果如能控制其誤差在一定范圍內，就說明該檢驗沒有發生不允許的誤差。如果出現超過允許誤差范圍的異常結果，提示該檢驗不合格，應尋找原因，糾正后，重檢待測標本。因此質控血清在質控工作中起重要作用。

1.質控血清的使用

衛生部臨床檢驗中心制備的乙肝標志物質控血清，可以在-20℃保持半年定值不變。冰凍狀態融化使用時，應先混勻，未用完部分可在4℃保存5天。不宜反復冰融或自行分裝。開展某項檢驗的室內質控工作需要的質控血清，一般按3-6個月用量準備。自制的不定值質控血清，在一批質控血清將用完之前，需準備下一批質控血清。質控血清要求性能穩定，較長期內效價不變，其理化性質應與病人樣本相近，這樣才能有效地起到監測作用。

2.臨界值質控血清

質控制血清分定值和未定值兩種。如只用一份質控血清定值，一般定在正常值與異常值交界點上，定性測定時處于弱陽性水平，稱為臨界值。乙肝標志物臨界值的制定，應按臨床要求，為臨床提供統一的判斷弱陽性的標準。 臨界值質控血清可以作為試劑盒中的陽性對照品和陰性對照品以外的第三個對照品，它可以靈敏地反映出試劑盒的檢出水平，確保弱陽性反應的標本不漏檢。

3.質控血清的制備

每個實驗室可以根據自己的條件，選用臨床中心提供的質控血清，或按以下方法自己制備本室使用的質控血清(以乙肝質控血清為例)。

(1)收集新鮮的無溶血、無黃疸、無細菌污染的陽性血清。

(2)56℃加熱10小時來活。

(3)離心或過濾除去沉淀。

(4)用10%的小牛血清或正常人血清(PBS緩沖液)將收集的血清稀釋至所需的濃度。如能用正常的人血清稀釋更好，因其成份更接近于檢測標本。

(5)抽濾除菌。按一次使用的量分裝小安瓿，封口，20℃保存備用。不可反復凍融。被檢物要求檢出的水平常被認為是質控血清應選擇的水平。如果該試驗還有其它要求，則應加所要求濃度的質控物。

(6)標定含量。20-30次測定結果刪除>±2SD數據的均值作為靶值，并與已知定值血清對比測定。

二、室內質量控制程序

臨床檢驗的檢測結果，每次或每天之間不可能*。決定允許的誤差范圍，以臨床上不造成誤診與漏診為準，通過以下步驟來確定質控范圍。

1.*條件下的測定誤差

*條件下已知值質控血清變異(optimal conditions variance,簡稱OCV)的測定：在本實驗室*條件下(包括操作者、試劑、儀器等)檢測質控血清20-30次，測得結果計算，求出該組數據的均值和標準差(SD)表示該實驗室的*工作質量。
 

現舉例說明HBsAg ELISA法檢測時OCV的測定。使用的質控制血清為臨界血清，HBsAg濃度為5ng/ml。在該實驗室中選擇素質、操作zui熟練的技術員進行認真地專門測定，選用*的試劑盒，檢測之前，將恒箱、加樣器等認真校正、調校正、調試，使用新的加樣吸頭等，即在*、的條件下進行檢測。除質控血清外同時測定陰性對照品和陽性對照品。并作雙份測定，得出2個吸光值(A值)，求出X。連續作20次，求出20個X，即X1……X20。從這20個數據中，求出OCV的X和SD。

2.已知值的血清在常規檢驗條件下的誤差

常規條件下已知值質控血清變異(routine conditions variance-known value,簡稱RCVK)的測定：做常規檢驗的技術人員，在常規檢驗的條件下，將質控血清放在常規檢測樣本中，進行20次檢驗，結果計算同OCV法。一般認為RCV的SD在OCV的SD兩倍范圍內可以接受。若太大應該查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改進實驗室條件后(例如較正加樣器，糾正洗板操作，調正溫育溫度等)，重新進行RCVK的測定。如果RCVK的SD值更小，說明OCV不是*條件下測定的，應重新再測OCV。常規條件下，RCVK肯定要比OCV大。通過質控控制各項條件，使RCVK的數據盡可能接近OCV值。RCVK的數據反映該實驗室日常工作的質量，用于作質控圖，對室內檢驗的結果進行控制，每日檢驗的結果，報告能否發出。

3.未知值的血清在常規檢驗條件下的誤差

常規條件下,未知值質控血清變異(routine conditions variancl-unknown value 簡稱RCVU)的測定：有時為了避免主觀性,再作RCVU測定。測定步驟同RCVK，但檢測的操作者不知質控血清的定值，或在操作者不知哪份是質控血汪清的條件下進行常規檢驗，以排除操作者的主觀性。在此不再舉例說明。

4.臨床應用的要求

對任何一個試驗都應確定一個允許的誤差范圍，前題是滿足臨床要求。如允許誤差定得過小，在臨床上不存在任何意義，但為了符合該規定卻要花費很大人力、物力和時間。相反，如果將允許誤差定得過大，將使監測系統察覺不到臨床上要求檢出的誤差，失去質控的意義。

三、室間質量評價(external quality assessment,簡稱EQA)

室間質量評價簡稱室間質評，是由質控中心采用一系列的辦法連續地、客觀地評價各實驗室的試驗結果，并發現室內質控不易發現的不準確性，了解各實驗室之間結果的差異，并幫助校正，使具有可比性。各實驗室試驗結果報到質控中心，經過統計分析，得出相互比較的結果。這種評價不能控制各實驗室每天發出的檢驗報告，而是一種回顧性評價。室內質控主要監測試驗結果的精密度，而室間質評主要控制試驗結果的準確度，不能互相替代。參與質評的實驗室應先做好室內質控。

1.室間質評的方法

(1)發質控物進行調查

這是國內外室間質評的常用形式。部臨檢中心對乙肝標志物ELISA檢驗的室間質評采用定期發放質控物至各實驗室，各實驗室在規定的日期進行檢驗，并將檢驗結果報至部臨檢中心。部臨檢中心經統計分析，將評價結果寄回各實驗室。通過評價，各實驗室了解本室工作質量，發現差距，并設法改進，以不斷提高檢驗質量。 這種評價方式有一定缺點，即各實驗室常對質控物特殊對待，在檢驗時選用特殊試劑盒，選派特別的技術員進行檢驗，有的實驗室互相和對結果并作修改。這就使EQA的結果不能反映該實驗室日常工作水平。

(2)派觀察員到實驗室進行試劑調查

這種調查事先不通知，臨時派觀察員到實驗室，采用常規方法，檢驗規定的一組標本，進行評價。這種調查方式，容易發現該實驗室存在的實際問題，可以直接給予指導和幫助，解決問題，提高檢驗質量。這種調查通常可以使用真實樣本，避免采用質控物的一些缺點。

2.評價方法

(1)發質控物進行調查，這是目前國內外常見的形式，采用定期發放質控物至各實驗室，各實驗室在規定的日期進行檢驗，并將結果報至組織者(部、省臨檢中心)。組織者通過統計分析，再將評價結果寄回實驗室，使其了解工作質量，發現問題，提高質量。其缺點為由于各實驗室吃小灶或互相打修改結果而達不到真正評價作用。

(2)現場調查，事先不通知，臨時派出人員到各實驗室，規定采用常規方法，檢測一組標本，進行評價。這種方法可以解決實際問題，進行現場指導，組織者常因人力、物力的原因而不能經常性進行。

3.成績計算方法

(1)定性試驗：檢驗結果與預期結果一致，得 100 分，錯誤不得分，總計實驗室的得分。從全部參評單位的得分中求出該批質控物平均分(X)和標準差(s)，再通過公式計算出每一個實驗室的得分比值(SI)

SI=(實驗室得分-平均分)/平均標準差(s)

SI 在0.0-0.9 間為良好,1.0-1.9 間為,SI 為負值時數值越大成績越差。

(2)定量試驗：SI= (實驗室測定值-預期值X)/預期值的標準差s ; SI 越小，表明越靠近靶值，成績越好。

0-1.0 為,1.1-2.0 為良好,>2.0 為差。SI 無正負之分

四、質量改進(Quality Improvement，QI)

質量改進的建議來源于三方面：

(1)室內質控：提示實驗的精密度差，應規范各項操作；

(2)室間質評：提示實驗的準確性差，應改進設備的準備或更換試劑；

(3)病人或醫生的報怨：提示實驗的偶然誤差，應分析實驗的質控過程是否達標。

五、記錄

1.所有實驗的原始資料均應存檔；所有的記錄均應規范登記在冊；原始登記表應記錄試劑來源、批號；質控血清的來源及測定值并注明是否在控；簽上實驗者姓名及審核者姓名。

2.如試驗結果對臨床診斷有決定意義，其樣本應保留，至少與病歷保存期一致。
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