兔抗鼠血清的應(yīng)用

背景[1-3]

兔抗鼠血清是將鼠IGG抗原分子分別以弗氏*佐劑（油包水溶性抗原分子）或弗氏不*佐劑，及水劑相結(jié)合的劑型免疫注射于兔子等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的不同部位，產(chǎn)生高效價(jià)抗體后，經(jīng)無(wú)菌低溫分離制成。免疫血清可廣泛的應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)的各個(gè)學(xué)科，特別在臨床免疫測(cè)定和免疫病理的診斷中更是必-備之材。

這里提供的抗血清產(chǎn)品經(jīng)過(guò)脂類(lèi)抽提以提高透明度，經(jīng)去鹽和透析處理以去除包含疊-氮-化-鈉的磷酸緩沖液，并后凍干以獲得凍干粉末。其中針對(duì)全血清蛋白的抗血清是通過(guò)完整血清免疫宿主動(dòng)物獲得，而針對(duì)所有IgG分子的抗血清則可與PAP聯(lián)用。

兔抗鼠血清

抗原的免疫方案根據(jù)其性質(zhì)不同而異以制備兔抗鼠IGG抗血清為例:

（1）抗原乳化：稱(chēng)取羊毛脂10g于研缽中，、逐滴加入石臘油40ml，逐滴研磨，高壓滅菌后備用。將上述不*福氏佐劑預(yù)熱至60℃，取3ml，逐滴加入0.5ml BCG（75mg/ml），繼續(xù)加入2.5ml人C3蛋白（2.4mg/ml），邊滴入邊研磨，直至達(dá)到“油包水"狀態(tài)。

（2）動(dòng)物免疫：選取健康新西蘭兔（3Kg左右），消毒局部皮膚，用1ml注射器吸取1ml乳化抗原，于兔每只腳掌皮下注入0.5ml。間隔2周后，將1ml乳化抗原多點(diǎn)（5－10點(diǎn)）注入兔腘窩及背部皮下。間隔2周后，在1周內(nèi)分別3次通過(guò)兔耳靜脈注射2.4mg/ml人C3蛋白液（分別為0.1ml、0.3ml、0.5ml），間隔1周后采用雙向免疫擴(kuò)散測(cè)定抗血清效價(jià)，當(dāng)效價(jià)達(dá)到1：16以上即可放血。

（3）放血：可采用頸動(dòng)脈放血法和心臟采血法。

（4）鑒定：采用雙向免疫擴(kuò)散或ELISA測(cè)定抗血清效價(jià)。

（5）保存：抗血清收獲后，加1/萬(wàn)硫柳汞或1/萬(wàn)的疊氮鈉防腐，或加入等量的中性甘油，分裝小瓶，置-20℃以下的低溫保存，數(shù)月至數(shù)年內(nèi)抗體效價(jià)無(wú)明顯變化。注意避免反復(fù)凍融。也可將抗血清冷凍干燥后保存。

兔抗鼠血清的應(yīng)用

用于FcγRⅡb在小鼠抗病毒免疫中的作用研究

以鼠FcγRⅡb的胞外域去除信號(hào)肽部分的基因序列為模板,設(shè)計(jì)特異性引物。以鼠肺泡巨噬細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,用PCR方法,擴(kuò)增FcγRⅡb胞外域目的片段,得到長(zhǎng)度為555bp的目的片段。將回收的FcγRⅡb胞外域片段連接到pET-28a載體中,經(jīng)鑒定測(cè)序正確后命名為pET-28a-FcγRⅡb。之后將其轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）菌株中進(jìn)行表達(dá),用摸索的佳條件大量誘導(dǎo)表達(dá)FcγRⅡb胞外域蛋白,用摸索的佳尿素濃度純化蛋白,純化的FcγRⅡb蛋白測(cè)過(guò)含量后分裝,-40℃保存。

將純化的FcγRⅡb胞外域蛋白與弗氏佐劑按1:1.2的比例制成免疫原,按1mg/kg免疫新西蘭大白兔,經(jīng)ELISA方法檢測(cè),兔抗鼠FcγRⅡb血清效價(jià)達(dá)到為1:12800時(shí)大量采血收集血清。經(jīng)Western blot檢測(cè),兔抗鼠FcγRⅡb抗體具有很強(qiáng)的特異性。用過(guò)硫酸銨粗提和ProteinG Sapharose 4xFast Flow柱子純化兔抗鼠FcγRⅡb IgG。純化后兔抗鼠FcγRⅡb IgG經(jīng)ELISA檢測(cè)其效價(jià)達(dá)到1:25600。激活FcγRⅡb后鼠腹腔巨噬細(xì)胞中天然免疫相關(guān)細(xì)胞因子的變化規(guī)律將從健康小白鼠腹腔中灌洗得到的鼠腹腔巨噬細(xì)胞用含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋到106個(gè)/mL,每孔500μL在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),將純化的兔抗鼠FcγRⅡb IgG和兔陰性IgG稀釋到500μg/mL,激活組和陰性對(duì)照組每孔加入200uL稀釋后的IgG,處理鼠腹腔巨噬細(xì)胞。

分別在處理鼠腹腔巨噬細(xì)胞后的12、24、36、48h收取各孔中的細(xì)胞,提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。采用RT-qPCR方法檢測(cè)天然免疫相關(guān)細(xì)胞因子IRF3、IFN-αIFN-β、IFN-γ、TNF-α、1L-1β、TGF-βmRNA水平,結(jié)果顯示,激活FcγRⅡb在12-48h上調(diào)巨噬細(xì)胞中干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3,干擾素IFN-α、IFN-β、IFN-γ,炎性因子TNF-α、IL-1β,和Toll樣受體TLR3的mRNA水平,下調(diào)免疫抑制因子TGF-βmRNA水平。說(shuō)明鼠FcγRⅡb的激活能上調(diào)巨噬細(xì)胞的天然免疫能力。

激活FcγRⅡb在鼠腹腔巨噬細(xì)胞在抗病毒免疫中的作用將從健康小白鼠腹腔中灌洗得到的鼠腹腔巨噬細(xì)用含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋到106個(gè)/mL,每孔500μL在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),將純化的兔抗鼠FcγRⅡb IgG和兔陰性IgG稀釋到500μg/mL,每孔200μL處理鼠腹腔巨噬細(xì)胞,作用2h后棄去上清,然后接種MHV,培養(yǎng)2h后將其棄去并補(bǔ)加維持液。

分別在補(bǔ)加病毒維持液后的12、24、36、48h時(shí),收取各孔細(xì)胞并提取總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,采用RT-qPCR方法測(cè)定MHV的拷貝數(shù)和天然免疫相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA水平。結(jié)果顯示,FcγRⅡb IgG-MHV試驗(yàn)組與兔陰性IgG-MHV組和MHV組相比,FcγRⅡb的激活仍能上調(diào)巨噬細(xì)胞中干擾素調(diào)節(jié)因子IRF3,干擾素IFN-αIFN-β、IFN-γ,炎性因子TNF-α、IL-1β和TLR3的mRNA水平,下調(diào)免疫抑制因子TGF-βmRNA水平,而且FcγRⅡb IgG-MHV試驗(yàn)組病毒拷貝數(shù)在24-48h低于陰性IgG-MHV對(duì)照組和MHV對(duì)照組。