ELISA檢測試劑盒中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并留意不行濺起，不行產生氣泡。

在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反響，即加標本和加酶結合物后。抗原抗體反響的完結需要有一定的溫度和時刻，這一保溫進程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當。

加標本一般用微量加樣器，按規則的量參加板孔中。每次加標本應更換吸嘴，避免發作交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規則的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參加稀釋液，ELISA試劑盒再在其間參加血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保 證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液進程迅速完結。
ELISA屬固相，抗原、抗體的結合只在固相表面上發作。

以抗體包被的夾心法為例，參加板孔中的標本，其間的抗原并不是都有平等的和固相抗結合的時機，只要貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體觸摸。這是一個逐步平衡的進程，因而需經分散才能達到反響的結尾。在其后參加的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這便是為什么ELISA反響總是需要一定時刻的溫育。

溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA試劑盒辦法作反響動力學研究時，實驗標明，兩次抗原抗體反響一般在37℃經1-2小時，ELISA檢測試劑盒產物的生成可達。為加速反響，可提高反響的溫度，有些實驗在43℃進行，但不宜選用更高的溫度。抗原抗體反響4℃更為*，在放射免疫測定中多使反響在冰箱中，以構成多的沉淀。但因所需時刻太長，在ELISA中一般不予選用。