在ELISA試劑盒實驗中的留意事項分為兩個關鍵：
一、做好對照
正式實驗時，應別離以陽性對照與陰性對照操控實驗條件，待檢樣品應作一式二份，以確保實驗成果的性。有時本底較高，闡明有非特異性反響，可選用羊血清、兔血清或BSA等關閉。
二、實驗條件的挑選
在ELISA中，進行各項實驗條件的挑選是很重要的，其間包括:
（1） 固相載體的挑選：很多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其方式可所以凹孔平板、試管、珠粒等。現在常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不論何種載體，在運用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反響，調查其顯色反響是不是均一性，據此判明其吸附功能是不是杰出。
（2） 包被抗體（或抗原）的挑選：將抗體（或抗原）吸附在固相載體外表時，請求純度要好,吸附時一般請求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時刻及其蛋白量也有必定影響,一般多選用4℃ 18～24小時。蛋白質包被的*適濃度需進行滴定：即用不一樣的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進行包被后，在其它實驗條件相一起，調查陽性標本的OD值。挑選OD值而蛋白量起碼的濃度。關于大都蛋白質來說一般為1～10μg/ml。
（3） 酶的底物及供氫體的挑選：對供氫體的挑選請求是價廉、安全、有明顯地顯色反響，而自身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌效果，應留意防護。有條件者應運用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是現在較為滿足的供氫體。底物效果一段時刻后，應參加強酸或強堿以停止反響。一般底物效果時刻，以10-30分鐘為宜。底物運用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前參加。（4） 酶符號抗體作業濃度的挑選：首先用直接ELISA法進行開始效價的滴定（見酶符號抗體部份）。然后再固定其它條件或采納“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶符號抗體別離為不一樣的稀釋度）在正式實驗體系里地滴定其作業濃度。