小鼠8羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）ELISA試劑盒僅供體外研究使用                                    

預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定小鼠組織勻漿、血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清、尿液或其它相關(guān)生物液體中8羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）含量。

 
概述
DNA鏈上的堿基鳥嘌呤C-8位易受到羥自由基及單線態(tài)氧的攻擊而發(fā)生羥化，生成加合物8-羥基脫氧鳥苷（8-hydroxy-2'-deoxyguanosine，8-OHdG）。8-OHdG是DNA氧化損傷的特異產(chǎn)物，是*的內(nèi)源性及外源性因素對DNA氧化損傷的生物標志物。8-OHdG是DNA氧化損傷的主要產(chǎn)物之一。在復(fù)制過程中，DNA鏈上8-OHdG可以與C以外的其它堿基配對形成點突變，其中GC→TA突變的發(fā)生已為大量研究所證實，并被認為是氧化應(yīng)激因素致癌、致突變的主要機理之一。機體修復(fù)機制正常時，8-OHdG可以在hOGG1等酶的作用下從DNA鏈上切除并重新?lián)饺胝５镍B嘌呤堿基，而切下的8-OHdG則可入血經(jīng)尿液排出體外。8-OHdG在體內(nèi)穩(wěn)定存在，一旦形成不再被機體進一步代謝，尿中8-OHdG含量與細胞內(nèi)DNA氧化損傷程度相關(guān)。目前機體8-OHdG水平已被廣泛接受為評價DNA氧化損傷的標志物，并用來估計氧化應(yīng)激相關(guān)癌癥發(fā)生的危險性。

 
實驗原理
用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗8-OHdG抗體的微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的抗8-OHdG抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的8-OHdG呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。

 
試劑盒組成及試劑配制
1.         酶聯(lián)板：一塊（96孔）

2.         標準品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為5,000 pg/ml，做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋）后，分別稀釋5,000 pg/ml，2,500 pg/ml，1,250 pg/ml，625 pg/ml，312 pg/ml，156 pg/ml，78 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標準濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。

如配制2,500 pg/ml標準品：取0.5ml（不要少于0.5ml）5,000 pg/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

3.         樣品稀釋液：1×20ml/瓶。

4.         檢測稀釋液A：1×10ml/瓶。

5.         檢測稀釋液B：1×10ml/瓶。

6.         檢測溶液A：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（每孔100ul），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10ul檢測溶液A加990ul檢測稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

7.         檢測溶液B：1×120ul/瓶（1:100）臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。

8.         底物溶液：1×10ml/瓶。

9.   濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。

10.  終止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。

11.  覆膜：1×5張
 
標本的采集及保存

1.         血清：全血標本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

2.         血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

3.         細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：請1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

4.         組織勻漿：將動物的組織標本先用PBS洗滌，去除多余血液，勻漿化后放在20ml PBS中于-20℃放置過夜，第二天，經(jīng)過二次反復(fù)凍融破膜，將勻漿物5000x g離心5分鐘，取上清即可檢測。

5.  樣本處理：血清或血漿標本推薦稀釋10倍，如：稀釋10倍，取10ul血清或血漿加入90ul樣品稀釋液。建議各實驗室在操作前先進行預(yù)實驗以建立*稀釋倍數(shù)。

注：以上標本置4℃保存應(yīng)小于1周，-20℃或-80℃均應(yīng)密封保存，-20℃不應(yīng)超過3個月，-80℃不應(yīng)超過6個月；標本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標本不宜進行此項檢測；高血脂的標本不需進行特殊處理，可直接檢測。
 
操作步驟
實驗開始前，請?zhí)崆芭渲坪盟性噭辉噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標準曲線。如樣品濃度過高時，均應(yīng)用樣品稀釋液進行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。建議各實驗室在操作前先進行預(yù)實驗以建立*稀釋倍數(shù)。

1.         加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標準品或待測樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。

為保證實驗結(jié)果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.         棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100ul（在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

4.         每孔加檢測溶液B工作液（同檢測A工作液） 100ul，37℃，60分鐘。

5.         溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。

6.         依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.         依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結(jié)果的準確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.         用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后立即進行檢測。

 
注：

1.         每次實驗留一孔作為空白調(diào)零孔（不同于空白孔），該孔不加任何試劑，只是zui后加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。

2.         嚴格按照規(guī)定的時間和溫度進行溫育以保證準確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達到室 溫。使用后立即冷藏保存試劑。

3.         洗板不正確可以導(dǎo)致不準確的結(jié)果。在加入檢測溶液B或底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，避免酶標板長時間處于干燥狀態(tài)。

4.         消除板底殘留的液體和手指印，否則影響OD值。

5.在儲存和溫育時避免強光直接照射。

6.未使用完的酶標板或者試劑，請于2-8℃保存。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，請配置標準品及工作液，盡量不要微量配置（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10ul），以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；檢測液A、B，以及底物溶液在使用前，應(yīng)置于37℃溫育30分鐘；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

7.建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。

 
洗板方法
手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水

紙，酶標板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需

要，重復(fù)此過程數(shù)次。
自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

 
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的小鼠8羥基脫氧鳥苷（8-OHdG），且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。

 
計算
  以標準物的濃度為橫坐標（對數(shù)坐標），OD值為縱坐標（普通坐標），在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線（推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3），根據(jù)樣品的OD值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

 
注意事項
1.         洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

2.         一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。

3.         請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。

4.         如標本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請zui后乘以稀釋倍數(shù)。

5.         在配制標準品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

6.         底物請避光保存。

 
檢測范圍：78 pg/ml - 5,000 pg/ml

 
zui低檢測限：39 pg/ml

 
ELISA試劑盒